你知道嘛，Western实验啊，简直就是个磨人的小妖精，能不能搞出漂亮的结果，很大程度上都得看样品准备得好不好。人家都说了，这实验的成功概率有70%以上都悬在蛋白样品的质量上呢。要是提取得不彻底、杂质没除干净、浓度还不一样，那到了后面跑电泳的时候，该淡的条带肯定淡，该糊的肯定糊，最后出来的数据啊，就像差之毫厘失之千里一样，差了老远呢。所以啊，咱们可得把这个“起点”给拿捏得死死的，别让自己白忙活一场。 其实呢，样品制备这事儿也就分六大步走嘛。第一步得选对裂解液。像RIPA、NP-40还有Triton X-100这些，各有各的长处。要是哺乳动物的细胞啊，最好选带蛋白酶抑制剂的配方，省得蛋白被它给消化了。pH值和盐浓度也得注意点，尽量和生理条件接近点，这样蛋白构象变化少点，后续抗体结合起来才顺手。 第二步就是把细胞给破碎了，让蛋白“走出来”。常见的有机械法、化学法和酶解法。机械法像超声波或者匀浆仪都可以用在贴壁细胞和组织块上。化学法就简单点了，冻融一下就行，特别是悬浮细胞特别管用。酶解法用酶裂解液温和处理一下，也能避免高温高压把蛋白给变性了。 第三步就是离心了，把那些“垃圾”都留在底部。这个步骤看着简单啊，却是去除不溶物最管用的关卡呢。咱们一般就把它放在15℃下15分钟吧，转数设个20000转就可以了。这样既能把细胞碎片甩干净，也能让大分子聚集体沉淀下来，免得堵了凝胶的孔眼。 第四步是测蛋白浓度啦。别瞎感觉哈，BCA、Bradford或者DC蛋白测定这些方法都不错，灵敏度不一样嘛。操作的时候记得按说明书来做标准曲线。吸光度读值要是在线性范围中间那段儿才最可靠呢。浓度太高就得稀释一下了。 第五步就是分装保存啦。蛋白样品要尽量小份分装快点冻起来（温度不高于-80℃），别老拿出来反复冻融的。加点甘油或者DTT还能进一步抑制蛋白酶的活性呢。 第六步就是上样缓冲液的事儿了。loading buffer里面的β-巯基乙醇或者DTT是用来还原二硫键的；甘油是让条带跑整齐用的。现用现加并且加热5分钟是铁律啊！ 当然啦，不同的样品还有点特殊处理技巧呢！比如贴壁细胞可以用“刮刀+EDTA”组合拳来消化收集；组织样本呢就“匀浆+超声”双保险一点；酵母和细菌就还用“碱裂解+酚抽”老办法就行啦！ 最后啊记得给我总结一下关键步骤：不管用什么方法破碎细胞，离心去除不溶物这步绝对不能省哦！上样前再检查一遍没沉淀没悬浮颗粒才行啊！这样后续的电泳才能顺利“通车”呢！