最近做WB遇到个麻烦事儿，跟大家分享一下。这回WB，我真的是一路踩到15个坑位才走过来。不过还好都解决了，把一些经验整理出来给大家参考参考。 第一件事就是WB条带弥散还有鬼影问题，这个真的让人头疼。几乎每个做过WB的人都会遇到这个问题，每次看到这种情况都紧张。其实主要原因就在蛋白酶活性上。有次我看了《Methods Mol Biol》上的文章，发现只要稍微注意一点就好了。 第二件事是高温和酸性对蛋白的影响，特别容易破坏蛋白结构。天冬氨酸-脯氨酸键对温度和酸碱度特别敏感。稍微一升温，这些键就断裂了，导致蛋白结构松散，电泳的时候就散成一片。我后来就把变性温度从95℃降到75℃，时间缩短到5分钟。不过有些蛋白还是很顽固，100℃烧几个小时也没事。 第三件事是55-65 kDa处的条带出现毛线团形状，这是角蛋白污染引起的。比如刷牙的时候蹭到口腔黏膜、皮屑、睫毛什么的，角蛋白就被带到样品里面了。这次我专门戴手套、帽子还有口罩避免这些污染问题。如果还是不放心，可以在上样前用蛋白酶抑制剂 cocktail 处理一下。 第四件事是一次性塑料制品里的残留问题。阳离子消毒剂和润滑剂很容易残留在一次性吸头和离心管里面。这次我特意把这些塑料制品用纯水冲洗一遍，再用甲醇或者DMSO涮两次去除干扰。还有尿素溶液里的氰酸铵也别小瞧它挥发后会在胶上留下鬼影。 第五件事是还原剂失效导致蛋白聚集体出现。有时候高温变性后直接上样的话，还原剂可能会部分氧化失效。这次我把样品冷却到60℃左右，再加碘乙酰胺室温孵育5分钟再进胶，结果就明显清晰了。 第六件事是PBS洗细胞会影响条带清晰度。PBS里面的盐离子会压缩蛋白结构导致上样后背景太亮影响结果。这次我尝试换用低盐缓冲液或者纯水洗两遍细胞再离心浓缩一下。 看完这些是不是觉得很紧张？别害怕，科研本来就是不断试错排雷的过程嘛。踩过的坑才是以后成功的伏笔呢！祝大家下次WB顺利出图！