PCR实验往往容易出现些小插曲。比如扩增无条带，我们在实验室里经常会看到电泳槽里一排排Loading Buffer，心里着急得不得了，却找不到任何目的条带。这通常是引物质量不好造成的。先别慌，把引物换了吧。把GC含量控制在40%到60%之间，碱基数控制在19到23bp之间。这样既保证了特异性，又兼顾了效率。要是高GC就减少碱基数量，要是低GC就增加一点碱基数量。与其硬扛引物的短板，不如给反应体系微调5℃的温差。非特异扩增也是常见问题，背景像烟花一样炸开。可能是模板浓度太高、引物特异性差或者有微量污染导致的。这个时候就给反应体系单独做个空管对照吧。常见污染来源有枪杆残留、外源核酸酶和水。枪杆残留是因为上次吸液时没彻底清洗干净；外源核酸酶可能来源于手套、PCR管架或者操作台面；水如果不是灭菌级别的，里面可能含有RNA酶。条带弱也不总是引物问题。模板“保质期”并不长：冻融别超过2次，4℃存放别超过7天；超过两天不处理就会像被酸雨腐蚀一样消失无踪。巢式PCR可以解决低浓度目标无法测序的问题。用全内切一对引物扩增第一轮产物后再作为模板进行第二次扩增，目标亮度会提升1-2个数量级。如果只想省钱也可以只用一个嵌套引物做半巢式反应效果接近却节省一半试剂。产物保存也是个大问题。实验室默认规则是4℃保存不要超过24小时；隔夜实验就直接胶回收吧；长期保存请转移至-20℃，并尽快转入-80℃冻存管里去。室温下停留时间越长降解风险越高。