先给你捋捋RNA Pull-Down这门实验怎么做。这个实验主要是看RNA是怎么把蛋白给“钓”上来的。你先准备一段被生物素标记过的RNA探针，让它在体外转录好，接着拿它去和细胞裂解液孵育。这样做能让探针和它想结合的蛋白搭成伙儿。然后用链亲和素磁珠来把这伙复合体给抓住，最后洗一洗就能通过Western Blot确认是不是真的把特定的RBP给揪住了。这一套流程短平快，能一下子把RNA“绑住谁”、“绑在哪儿”、“绑得牢不牢”这几个问题给交代清楚。 再说说lncRNA研究的路子。首先得把不同样本里那些表达量有差异的lncRNA给筛出来。拿芯片或者测序做个对比，找出那些明显变多或者变少的转录本；再用生物信息学的法子建个共表达网络，猜一猜潜在的靶基因是啥；最后用PCR或者Northern Blot回头再验证一遍，看是不是真的有区别。接着就要把这全长的序列给补齐，用上5' RACE和3' RACE这几招，把5'端和3'端一次性全接上，这才算拿到了它的“身份证”。然后要画个表达谱全景图，看看它在不同的细胞系里表现咋样，在不同组织和发育阶段里含量如何，还要看看它在药物或者敲低处理后的时间线里怎么变。 接下来就是干功能研究这块儿。可以先把全长的lncRNA克隆到载体上转染过去看看表型怎么样；要是想看看没了它行不行，就用siRNA或者shRNA、反义核酸这“三连击”敲低它。这时候就要用上RNA pull-down、RNA-RIP、ChIRP-seq这些技术了，把和它勾肩搭背的DNA、RNA还有蛋白全都给拎出来分析一下。机制这块可以用lncRNA芯片和mRNA芯片联合分析一下是顺式还是反式调控；要是觉得麻烦还能用SELEX技术设计点小分子配体去堵住肿瘤lncRNA。 RNA Pull-Down实验流程咱也拆开来看看。先拿质粒转化感受态细菌，把细菌和质粒放在冰上30分钟；接着42℃热休克90秒；再冰浴2分钟。加50 µl LB（没Amp）摇0.5小时；涂在带Amp的平板上倒置过夜。挑个单克隆放进5 ml带Amp的LB里摇18小时；最后用DP107-02这套试剂盒提出来。 质粒线性化要用KpnⅠ酶切一下电泳看看切得好不好；琼脂糖凝胶回收要切胶称重溶解；吸附柱回收漂洗晾干；用EB洗脱后室温放2分钟；浓度得超过100 ng/µl才行。体外转录用T7或者SP6的酶来做；用DNaseⅠ去掉DNA；探针95℃变性2分钟、冰浴3分钟、室温折叠30分钟；链亲和素磁珠4℃过夜抓住RNA；洗脱后加裂解液再孵育1小时。 裂解液上样跑胶前要低速离心冲洗三次；加5×SDS上样缓冲液95℃变性10分钟跑胶；考马斯亮蓝过夜脱色；条带清清爽爽就说明成功了。 RNA降解可能是环境被污染或者探针自己坏掉了；解决办法是换新管头和试剂；电泳看看带型有没有变毛躁。 亲和力不够可能是温度盐度磁珠量探针量不对；得把孵育时间温度盐浓度都查一遍；裂解液和上样蛋白比例得大于1比5；磁珠量翻倍；用亲和素ELISA测测生物素效率。 没结合可能是蛋白太少或者体系不对；多加样换低盐体系加点BS3交联试剂定住蛋白。 非特异性高可能是体系太宽松裂解不彻底；改高盐为低盐降低探针浓度裂解液得够大把杂质稀释掉。 WB信噪比低可能是信号弱一抗不行蛋白没溶开；二抗量翻倍换高灵敏发光液裂解液预孵一抗去除杂抗样品量至少20 µg总蛋白。