用3%的过氧化氢溶液把组织泡个10到15分钟，就能把血液、骨髓这些高活性组织里的内源性HRP给灭活掉，后续DAB显色就不会在胞质里泛起棕褐色的背景了。如果是AP体系，碰到肾脏或淋巴组织时，左旋咪唑溶液能阻断碱性磷酸酶的活性，免得底物被吃掉变成蓝紫色背景；不过要是做肠道样本检测，最好换成0.3 M的乙酸会更稳妥。针对肝脏、肾脏、心脏或脑组织自带的生物素干扰，在ABC法或LSAB法里就要用两步操作来把它们封死：先让抗生物素蛋白去和组织抢位子，再把生物素溶液灌进去把所有剩余的结合位点堵住。至于血清、BSA、明胶或者脱脂奶粉这些蛋白质封闭溶液，核心目的就是用大量的蛋白质把细胞表面的所有非特异性位点占满，这样一抗和二抗就没缝可钻了。需要注意的是，血清的物种要和二抗匹配才行；如果体系里含生物素化蛋白，千万不能用牛奶当封闭液。BSA和明胶对AP体系的背景比较友好，而脱脂奶粉更适合HRP系统。 到底要不要做封闭步骤其实是可以商量的，但它绝对是个保险栓。预处理完之后封闭往往被当成可有可无的小节给忽略了，实际上它直接决定了背景的高低。选哪种封堵剂得看一抗种类、二抗来源、用的是什么检测酶系统，还有组织本身自带信号的强弱。说到底就是想降低假阳性，就得给那些非特异性的位点找个替身去占位。 在正式开始染色之前，跑张阴性对照是必不可少的验证步骤：拿一块已知没有目标抗原的切片按同样的流程走一遍。要是对照上出现了颜色信号，那就说明封闭剂的浓度不够或者孵育时间没到；只有对照干干净净没有一点杂色的时候，才能放心地进入后续的抗体染色环节。