咱也别把细胞整得太娇气，虽然它们能无限增殖可终究是会老的。为了维持战斗力，咱们得给它们安排一个“冬眠”，就像把睡美人关进水晶棺，等实验室需要的时候再一键复活。这个过程有个黄金法则叫慢冻快融。 慢冻这一步，得靠甘油或者DMSO这种保护剂帮忙，把细胞里的水给“赶”出去，少结冰少受伤害。等冻起来以后，复苏的时候就得反过来让它在一瞬间融化，防止水再渗进去冻伤。咱们操作的时候记得用这些材料：1-2毫升的冻存管、水浴箱、液氮、还有那个DMSO04。 具体流程呢，一共分四步来把细胞封印进液氮。第一步先配好液体，经典的配方是10%的DMSO加上30%的血清和60%的培养基。血清里那些大分子的非渗透性物质能把细胞抱成一团更好保护。第二步收细胞跟平时传代一样，取对数期的用胰酶消化再离心。第三步用冻存液轻轻把细胞吹散开，按照5×10⁶到1×10⁷每毫升的密度分装进冻存管，全程得冰上操作。 第四步有两种降速方案选一种就行。一种是传统的阶梯降温法：4度十分钟、-20度半小时、-80度16到18小时或者过夜最后送去液氮保存。中间还要颠倒一下混匀防止细胞沉底贴壁。另一种是用程序降温盒，外面包层棉花在-80度放一晚直接送液氮箱。 复苏也不难分三步来做。第一步从液氮桶里拿出来以后立刻放到37度水浴里快速摇晃融化，尽量控制在一分钟内完成；如果用移液器转移的话动作得快点最好三分钟内搞定，避免DMSO毒性太高。第二步把融化的液体移到离心管里1000转离心五分钟倒掉上清后再加培养基吹匀。 最后一步铺板传代就行了：把细胞悬液倒进提前加了7到9毫升培养基的大皿里培养过夜；第二天换液看看密度决定要不要传代。 想让这些细胞长期保鲜的话还得注意几点：标签要防水用那种耐低温的笔写清楚名字代数和日期；冻存盒的架子最好画个地图省得以后伸手进去瞎找；操作液氮的时候一定要戴厚手套别冻伤了。学会了这一套咱们就能给细胞把“年龄”冻住了，让实验室随时都有状态满格的预备军可用。